Электронный научный журнал

ГЕРОНТОЛОГИЯ
«GERONTOLOGY» Scientific Journal

БИОГЕРОНТОЛОГИЯ

PEPTIDES TISSUE-SPECIFICALLY STIMULATE THE EXPRESSION OF SIGNALING MOLECULES IN THE SPLEEN CELL CULTURES OF DIFFERENT AGE ANIMALS

Linkova N.S.1,2, Chervyakova N.A.1, Dudkov A.V.1, Kostylev A.V.1, Tendler S.M.3
1. Saint Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology, St. Petersburg, Russia
2. Saint Petersburg Polytechnical University
3. Karolinska University Hospital, Solna, Stockholm, Sweden
Full file PDF (469 Kb)
УДК 577.24

Введение. Иммунная система осуществляет защитную функцию и участвует всохранении гомеостаза на органно - тканевом и молекулярно-клеточном уровне. В поддержании функциональной активности и взаимодействия иммунной системы с нервной и эндокринной системами участвуют сигнальные молекулы. Древнейшими в эволюции и одними из наиболее многофункциональных сигнальных молекул являются регуляторные пептиды. Так, нейропептиды VIP (vasoactive intestinal peptide) и CGRP (calcitonin gene related peptide) синтезируются в иммунных клетках, а с возрастом уровень их экспрессии снижается [1, 12].

Возрастная инволюция иммунной системы характеризуется снижением иммуногенеза в тимусе и селезенке, что приводит к развитию онкологической и аутоиммунной патологии. Основным проявлением старения селезенки является изменение миграции В-лимфоцитов, нарушение процессов клеточного обновления и синтеза ряда сигнальных молекул (опиоидные пептиды, пролактин, VIP, окситоцин, аргинин-вазопрессин, соматостатин, нейрофизин) [2].

Таким образом, в основе старения иммунной системы лежит снижение синтеза регуляторных пептидов и ослабление чувствительности к ним клеток-мишеней [11]. Нарушение пептидной регуляции снижает резистентность иммунных клеток к дестабилизирующим факторам внешней и внутренней среды и может являться одним из механизмов ускоренного старения и развития ряда заболеваний.

Установлено, что применение пептидных биорегуляторов (ПБ), разработанных в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии, позволяет восстановить функциональную активность иммунной системы при возрастной инволюции.

Применение ПБ тимогена (Glu-Trp) и дипептида АВ-0 (Lys-Glu) оказалось эффективным при ряде заболеваний, связанных со снижением клеточного иммунитета: при химиотерапии у онкологических больных, инфекционно-воспалительных заболеваниях и в постоперационном периоде [5]. Дипептид АВ-0 способен проникать в ядро и ядрышко клеток и связываться с ДНК и гистонами [6]. Молекулярный механизм иммунопротекторного действия ПБ связан с их способностью стимулировать пролиферацию и дифференцировку тимоцитов [3, 4, 9, 10].

Цель исследования: сравнительное изучение действия ПБ на экспрессиюсигнальных молекул в культурах клеток селезенки животных разного возраста.

Материал и методы. Селезенку молодых(3мес.)и старых(24мес.)крыс линииWistar разделяли на эксплантаты (фрагменты величиной около 1 мм3) и культивировали в чашках Петри в 3 мл питательной среды по описанной ранее методике [8]. Питательная среда включала в себя 35% среды Игла, 35% раствора Хенкса, 25% фетальной телячьей сыворотки, 0,6% глюкозы, 0,5 ед/мл инсулина и 100 ед/мл гентамицина. Эксплантаты селезенки в течение 3 сут культивировали в инкубаторе при температуре 36,7оС в условиях постоянного поступления 5% СО2. Культуры клеток селезенки были разделены на 4 группы: контрольную – с введением физиологического раствора и 3 экспериментальные – с добавлением пептидов АВ-0 (исследуемый пептид), Т-33 (отрицательный контроль) и тимоген (положительный контроль). Пептиды добавляли в культуры в следующих концентрации 0,05 нг/мл.

Для изучения экспрессии сигнальных молекул органотипические культуры фиксировали охлажденным до -20ºС 96% этиловым спиртом и проводили пермеабилизацию клеток 0,5% Triton X–100. Для иммуноцитохимического окрашивания клеток селезенки использовали первичные моноклональные антитела к Ki67 (Novocastra, 1:50), p53 (Novocastra, 1:50), CD5 (Dako, 1:50), CD20 (Dako, 1:50) и CD68 (Dako, 1:50). Для оценки результатов иммуноцитохимического окрашивания проводили морфометрическое исследование с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Nikon Eclipse E400, цифровой камеры Nikon DXM1200, персонального компьютера на базе Intel Pentium 4 и программного обеспечения «Vidеotest Morphology 5.2». Относительную площадь экспрессии рассчитывали, как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах.

Статистическую обработку результатов выполняли с помощью программы Statistiсa 7.0 с предварительной проверкой соответствия рассматриваемых переменных нормальному распределению по критерию Шапиро–Уилка. Для проверки статистической однородности нескольких выборок были использован непараметрический Н-критерий Крускала–Уоллиса.

Результаты исследования и их обсуждение. В культурах клеток селезенкимолодых крыс пептид АВ-0 повышал экспрессию маркеров CD20 и CD68 – площадь экспрессии возрастала соответственно на 21% и 35% (табл. 1). Тимоген способствовал увеличению площади экспрессии CD20 и CD68 в 1,6 раза. Пептид Т-33 в отличие от АВ-0 и тимогена не влиял на экспрессию маркеров иммунных клеток, что указывает на тканеспецифическое действие пептидов АВ-0 и тимогена.

В  культуре клеток селезенки старых крыс пептид АВ-0 индуцировал увеличение экспрессии CD20 в 1,4 раза и CD68 в 1,7 раза по сравнению с контролем. Под действием тимогена площадь экспрессии Ki67 возрастала в 2 раза, CD20 – в 2,5 раза и CD68 – в 1,6 раза (табл. 2). Пептид Т-33 не влиял на синтез исследуемых маркеров иммунокомпетентных клеток. Таким образом, в культурах клеток, полученных от старых животных, тимоген и пептид АВ-0 стимулировали иммуногенез, а пептид Т-33, специфичный к нервной ткани, не обладал таким эффектом.

Заключение. Полученные данные свидетельствуют о выраженномтканеспецифическом действии ПБ на экспрессию сигнальных молекул в культурах клеток селезенки молодых и старых животных, что согласуется с полученными ране данными об иммунопротекторном действии коротких пептидов на тимус [7]. Пептиды АВ-0 и тимоген обладают стимулирующим эффектом в отношении иммунных клеток селезенки. Макрофаги селезенки осуществляют утилизацию эритроцитов, а В-лимфоциты участвуют в противоопухолевой и антивирусной защите организма.

Следовательно, пептидергическая активация данных субпопуляций иммунокомпетентных клеток при старении организма открывает новые пути к поддержанию иммуногенеза при возрастной патологии.

Список литературы.

  1. Кветной И.М. Структурно-функциональное сходство пинеалоцитов и клеток тимуса / И.М. Кветной, В.О. Полякова, Н.С. Линькова // Иммунология. - 2011. - Т. 32, № 3. - С. 131 -134.
  2. Кузнецова Е.П. Селезенка: онтогенез и старение / Е.П. Кузнецова, Н.С. Линькова, А.В. Дудков, М.А. Войцеховская // Геронтологический журнал им. В.Ф. Купревича. - 2011. - Т. 2, № 2. - С. 9 - 16.
  3. Хавинсон В.Х. Морфофункциональные основы пептидной регуляции старения / В.Х. Хавинсон, Н.С. Линькова, А.В. Трофимов [и др.]. // Успехи современной биологии. - 2011. - Т. 131, № 2. - С. 115 - 121.
  4. Хавинсон В.Х., Серый С.В., Малинин В.В. Средство, обладающее иммуномодулирующей активностью // Патент РФ № 2080120. 1997.
  5. Anisimov V.N. Peptide bioregulation of aging: results and prospects / V.N. Anisimov, V.Kh. Khavinson // Biogerontology. - 2010. № 11. - P. 139 - 149.
  6. Fedoreyeva L.I. Interaction of Short Peptides with FITC-Labeled Wheat Histones and Their Complexes with Deoxyribooligonucleotides / L.I. Fedoreyeva, T.A. Smirnova, G.Ya. Kolomijtseva [et al.]. // Biochemistry. - 2013. - Vol. 78, № 2. - P. 166 - 175.
  7. Khavinson V.Kh. Tissue-Specific Effects of Peptides / V.Kh. Khavinson // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2001. - Vol. 132, № 2. - P. 807 - 808.
  8. Khavinson V.Kh. A Method of Creating a Cell Monolayer Based on Organotypic Culture for Screening of Physiologically Active Substances / V.Kh. Khavinson, N.S. Linkova, V.E. Pronyaeva [et al.]. // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2012. - Vol. 153, №  5. - P. 795 - 799.
  9. Khavinson V.Kh. Peptides Regulate Cortical Thymocytes Differentiation, Proliferation, and Apoptosis / V.Kh. Khavinson, V.O. Polyakova, N.S. Linkova [et al.]. // Journal of Amino Acids. – 2011. - Vol. 2011. – Р. 1 - 5.
  10. Morozov V.G., Khavinson V.Kh. Thymus-gland preparation and method for producting same // United States Patent № 5, 070, 076. 1991.
  11. Straub R.H. The process of aging changes the interplay of the immune, endocrine and nervous systems / R.H. Straub, M. Cutolo, B. Zietz [et al.]. // Mech Ageing Dev. - 2001. - Vol. 122, № 14. - P. 1591 - 1611.
  12. Wimalawansa S.J. Age-related changes in tissue contents of immunoreactive calcitonin gene-related peptide / S.J. Wimalawansa // Aging. - 1992. - Vol. 4, № 3. - P. 211 - 217.
Keywords immune system, peptides, targeted action, cell cultures, ageing.

Full file PDF
Linkova N.S., Chervyakova N.A., Dudkov A.V., Kostylev A.V., Tendler S.M., PEPTIDES TISSUE-SPECIFICALLY STIMULATE THE EXPRESSION OF SIGNALING MOLECULES IN THE SPLEEN CELL CULTURES OF DIFFERENT AGE ANIMALS // «GERONTOLOGY» Scientific Journal. - 2014. - №2;
URL: http://www.gerontology.su/magazines?textEn=164 (date of access: 19.11.2017).

Code to embed on your website or blog:

Article views:
Today 1 | Week 7 | Total: 222